Verschillende soorten PCR: belangrijke conceptuele MCQ's

by

Inhoud

Verschillende soorten PCR

Polymerase kettingreactie (PCR) wordt algemeen geclassificeerd op basis van kleine wijzigingen in het standaard PCR-proces. Verschillende soorten PCR zijn als volgt:

Geneste PCR

Deze techniek wordt voorgesteld om de verontreinigingen in geamplificeerd DNA te verminderen vanwege willekeurige primer-bindende amplificatie. Geneste PCR wordt uitgevoerd met twee verschillende sets primers in twee opeenvolgende PCR-cycli. De volgende set zal naar verwachting het secundaire doel in het product van de primaire run versterken. Deze techniek is buitengewoon succesvol, hoewel het veel meer kennis van de betrokken sequenties vereist. 

Omgekeerde PCR

Het wordt uitgevoerd wanneer slechts één interne sequentie van template-DNA bekend is. Deze techniek is geschikt voor de identificatie van de flankerende sequenties van de verschillende geninserts. Het proces omvat een sequentie van vertering en zelfligatie van het template-DNA, wat resulteert in stukjes DNA met bekende sequenties aan de uiteinden van een onbekende sequentie.

Verschillende soorten PCR
(Verschillende soorten PCR): weergave van de moleculaire structuur van Taq-polymerase https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

Omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR)

Het wordt gebruikt om bekende sequenties uit RNA-bibliotheken te amplificeren en te identificeren. Het uit het monster verkregen RNA wordt vervolgens omgezet in complementair DNA (cDNA) door de werking van enzym reverse enzym transcriptase. Typische PCR is daarna uitgevoerd. RT-PCR wordt veel gebruikt bij identificatie en de bepaling van genexpressie.

Verschillende soorten PCR
(Verschillende soorten PCR): RT-PCR gebruikt fluoroforen om de niveaus van genexpressie te detecteren https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

Asymmetrische PCR

Het versterkt selectief de ene streng van het sjabloon-DNA meer dan de andere. Het wordt gebruikt bij het hybridisatieproeven waarbij slechts één streng als ideaal wordt beschouwd. Verdere amplificatie wordt bereikt door standaard PCR uit te voeren in aanwezigheid van overmaat primers voor de gekozen streng. 

Kwantitatieve PCR (Q-PCR)

Dit is de indirecte procedure voor het meten van initiële hoeveelheden RNA, cDNA of template-DNA. Q-PCR wordt over het algemeen gebruikt om de hoeveelheid PCR-product snel te bepalen. Q-PCR wordt ook gebruikt voor de detectie van specifieke sequenties in het DNA-monster.

Kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR of RTQ-PCR)

Dit proces maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen om realtime hoeveelheden geamplificeerde producten te volgen en te meten. Deze kwantitatieve real-time PCR wordt gebruikt in conjugatie met QPCR.

Touchdown-PCR

Deze techniek vermindert de niet-specifieke primerbinding door de annealingstemperatuur tussen twee opeenvolgende PCR-cycli te verlagen.

Kolonie PCR

Klonen (bijv. E. coli) worden geanalyseerd op de juiste ligatieproducten. Een specifieke kolonie wordt door een steriele tandenstoker geplukt en in de mastermix gebracht. De PCR wordt bediend met verlengde tijd op 95oC.

Allelspecifieke PCR

Deze techniek is gebaseerd op het single nucleotide polymorphism (SNP's), allelspecifieke PCR wordt vaak gebruikt voor klonering en diagnostische doeleinden. Enige voorkennis over de DNA-sequentie van allelen en hun verschil is vereist. Allelspecifieke PCR omvat het gebruik van primers SNP die 3 'uiteinde bevatten. Succesvolle allelspecifieke PCR-amplificatie en SNP-specifieke primers duiden op de aanwezigheid van bepaalde SNP in de sequentie.

Polymerase Cycling Assembly (PCA) of Assembly PCR

Betreft de kunstmatige productie van de lange DNA-sequenties in aanwezigheid van lange oligonucleotiden en korte overlappende segmenten volgens de standaard PCR-procedure. De lange oligonucleotiden draaien in beide richtingen (sense en antisense), het overlappende segment bepaalt de volgorde van de PCR-fragmenten, wat de selectieve productie van het uiteindelijke lange DNA mogelijk maakt.

Lineair-na-de-exponentiële PCR (LATE-PCR)

Bij deze techniek heeft de beperkende primer (primer aanwezig in de lagere hoeveelheid) een hoger smeltpunt dan de overtollige primer (primer aanwezig in voldoende hoeveelheid) om de reactie-efficiëntie te behouden, aangezien de concentratie van de beperkende primer halverwege de reactie afneemt . 

Uitbellen PCR

Het is een methode om DNA-moleculen terug te winnen voor de gensynthese. Een bibliotheek van DNA wordt vóór de sequentiebepaling gemodificeerd met specifieke flankerende tags. Later maken de tag-gerichte primers het herstel van DNA van gewenste sequenties door PCR mogelijk.

Helicase-afhankelijke versterking

Het is verwant aan de traditionele PCR, maar het gebruikt een constante temperatuur in plaats van cyclisch. DNA-helicase wordt gebruikt in plaats van de thermische denaturatiestap. 

Hotstart-PCR

Deze techniek ontsloeg de mogelijkheid van niet-specifieke amplificatie tijdens de eerste cycli van PCR. De reactie-ingrediënten worden verwarmd tot de denatureringstemperatuur van 95oC vóór de toevoeging van polymerase. Remmers en antilichamen worden in het reactiemengsel geïntroduceerd om te remmen DNA-polymerase activiteit, die bij hoge temperaturen wordt gedissocieerd. 

Intersequentie-specifieke PCR

Deze modificatie van de PCR-techniek wordt vaak gebruikt voor het maken van DNA-vingerafdrukken, waarvoor de amplificatie van gebieden tussen de eenvoudige sequentieherhalingen vereist is om een ​​unieke en specifieke vingerafdruk / patroon van geamplificeerde DNA-fragmenten te genereren. 

Ligatie-gemedieerde PCR

Het maakt specifiek gebruik van kleine (in te voegen) linkermoleculen van DNA en verschillende primers die in staat zijn te hybridiseren met het linker-DNA. Deze techniek wordt veel gebruikt voor DNA-sequencing en footprinting.

Methyleringsspecifieke PCR

Deze techniek wordt gebruikt voor de detectie van CpG-eilanden in het genoom. Bij methyleringsspecifieke PCR wordt DNA behandeld met natriumbisulfaat, dat de ongemethyleerde cytosinebase omzet in uracil, dat wordt geïdentificeerd / herkend door de PCR-primer thyminebasen. Twee verschillende PCR-sets worden uitgevoerd op het veranderde DNA met behulp van identieke primersets, behalve de CpG-eilanden van de primers. De primersets herkennen de cytosinebasen en andere sets primers herkennen de uracil om het ongemethyleerde DNA te amplificeren. Q-PCR kan ook worden uitgevoerd om de kwantitatieve informatie over methylering te kennen. 

Conceptuele MCQ's over verschillende soorten PCR (opgelost)

Vraag 1: Een onderzoeker probeert vijf opeenvolgende basenparen in het midden van een met PCR geamplificeerde DNA-fragmenten te veranderen. Welke techniek wordt het meest aanbevolen om een ​​dergelijk experiment uit te voeren?

A- DNA-ligatie

B- Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA)

C-PCR-mutagenese

D- Restrictie-enzym spijsvertering

Goed antwoord: Optie C PCR-mutagenese 

Uitleg:

De meest aanbevolen techniek voor dergelijke modificaties is PCR-mutagenese. Het kan primers synthetiseren die niet perfect binden op de gewenste plaats van mutagenese. Deze primers zullen nu de nieuwe sequentie van 5 basenparen bevatten die in de nieuwe DNA-streng wordt geïntroduceerd. Ten eerste zal de PCR het DNA-fragment met de mutante sequentie en de stroomopwaartse sequenties amplificeren. De tweede PCR-cyclus zal de nieuwe DNA-streng met de mutante sequentie en ook de stroomafwaartse sequenties amplificeren. En de laatste PCR-cyclus zal één DNA-fragment van de twee sjablonen amplificeren, waarbij de originele primers worden gebruikt om de DNA-streng van volledige lengte te amplificeren.

Vraag 2: Polymerase-kettingreactie (PCR) maakt gebruik van een hittebestendige polymerase (Taq-polymerase) om de DNA-streng te versterken. Welke van de beweringen beschrijft het beste waarom thermo-stabiele polymerasen nodig zijn voor PCR?

A-PCR heeft thermische cycli nodig en de Taq-polymerasen kunnen worden geïnactiveerd omdat ze niet nodig zijn tijdens de stappen bij lage temperatuur. 

B- Hittebestendige (Taq) polymerase breken het dsDNA niet tenzij de temperatuur erg hoog is. Daarom is een warmtestabiele (Taq) polymerase vereist.

C-PCR heeft thermische cycli nodig, en de hittestabiele (Taq) polymerasen zullen niet denatureren om de werkzaamheid bij DNA-polymerisatie tijdens de hoge temperatuur te verliezen (95oC) stap. 

D- De interactie tussen tweewaardige kationen en DNA-polymerase is veel efficiënt tijdens stappen bij hoge temperatuur. PCR vereist dus warmtestabiele DNA-polymerase.

E- Hittebestendige (Taq) polymerasen zijn goedkoper dan standaardpolymerasen; dus zijn ze geschikter voor het versterken van DNA. 

Correct antwoord: optie C

PCR vereist thermische cycli en de hittestabiele (Taq) polymerasen zullen niet denatureren om de werkzaamheid bij DNA-polymerisatie tijdens de hoge temperatuur te verliezen (95oC) stap. Dit maakt het uniek onder verschillende soorten PCR.

Uitleg:

Polymerasen denatureren vaak bij hogere temperaturen. Als een standaardpolymerase zou worden gebruikt, zou het denatureren tijdens een stap bij hoge temperatuur (denaturatie), wat nodig is voor het breken van het dubbelstrengs DNA in enkelstrengs DNA-templates. Door gebruik te maken van deze hittestabiele (Taq) polymerase, enzym zal niet denatureren. De DNA-strengen zullen zich blijven amplificeren door het Taq-polymerase dat aan het begin van de PCR is toegevoegd.

Vraag 3: Wat is de juiste volgorde van de drie stappen van PCR?

A- Verlenging, denaturatie, gloeien

B- Denaturatie, gloeien, verlenging 

C- Gloeien, extensie, denaturatie

D- Denaturatie, verlenging, gloeien

Juist antwoord: optie B

Denaturatie, gloeien, verlenging 

Uitleg:

De stappen van PCR omvatten denaturatie, annealing en extensie.

Denaturatie wordt gedaan bij een temperatuur rond 94-98 ° C om waterstofbruggen van dubbelstrengs DNA te verbreken. 

Gloeien is de tweede stap van PCR die is voltooid bij 50-65 ° C. De versmeltingsstap moet worden uitgevoerd bij een lage temperatuur voor de hechting van primers aan de enkele streng, maar hoog genoeg om niet-specifieke hybridisatie te vermijden. 

De verlengings- of verlengingsstap van PCR stelt het DNA-polymerase in staat om de laatste kopie van de sjabloon-DNA-streng te synthetiseren. De optimale temperatuur hangt af van het gebruikte DNA-polymerase, maar varieert gewoonlijk van 75-80 ° C.

Vraag 4: Welke van de volgende is wel / geen bestanddeel van een polymerasekettingreactiemengsel?

A- Bufferoplossing

B- DNA-polymerase

C-formamide

D- DNA-templaatstreng

Correct antwoord: optie C

Formamide

Uitleg:

De ingrediënten van PCR zijn DNA (Taq) polymerase, buffer, primers, magnesiumchloride, dNTP's (adenine, guanine, cytosine, thymine), deoxynucleotide-trifosfaten en de DNA-templaatstreng.

Conclusies

In dit artikel hebben we verschillende soorten PCR besproken. Bezoek voor meer informatie over dit onderwerp verschillende soorten PCR.

Voor meer onderwerpen over biosynthese en biotechnologie u kunt onze pagina's bezoeken.

Lees ook: