Polymerasekettingreactie: 9 belangrijke verklaringen

Inhoud

Wat is polymerasekettingreactie?

Polymerase kettingreactie (PCR) is een andere veelgebruikte methode moleculaire biologie techniek voor het enzymatisch produceren van DNA zonder gebruik te maken van cellulaire machinerie, bijvoorbeeld gist of E. coli. De methode staat een beperkte hoeveelheid van de DNA te versterkte verschillende plooien dramatisch. PCR wordt regelmatig gebruikt in klinisch, gerechtelijk, en biologische laboratoria voor verschillende doeleinden, zoals bepalen genetische vingerafdrukken, ziekte diagnose, gen klonen, en vaderschapstesten. 

Deze techniek werd in 1983 bedacht door Kary Mullis. PCR is momenteel een cruciale en belangrijke procedure die wordt gebruikt in de toegepaste biologie. Deze omvatten DNA-klonen voor sequentiebepaling, op DNA gebaseerde fylogenie of actief onderzoek van genexpressie en de bepaling van genetisch overdraagbare aandoeningen. In 1993 ontving Mullis de Nobelprijs voor Scheikunde voor zijn werk aan PCR. 

De PCR wordt over het algemeen gedragen in een reactiemengsel met een totaal volume van 0.1-0.2 ml in reageerbuisjes (0.2-0.5 ml volumes) in een instrument dat bekend staat als een thermische cycler​ Een thermische cycler verwarmt en koelt het DNA af om de temperaturen te bereiken die nodig zijn in elke stap van de reactie. De dunwandige reactiebuizen bieden de gewenste thermische geleidbaarheid, waardoor een snellere thermische equilibratie mogelijk is. Gewoonlijk hebben de thermische cyclers verwarmde bovenkanten of deksel die condensatie van reactiecomponenten aan de bovenzijde van de buis voorkomen. 

Vereisten voor polymerasekettingreactie

• DNA fragment dat moet worden geamplificeerd (template-DNA of cDNA)
• primers (forward primer en reverse primer) in staat om uiteinden van het template-DNA te herkennen. Primers zijn gewoonlijk 18-25 basenparen lang.
• Thermostabiel DNA-polymerase (Taq-polymerase) katalyseert de DNA-synthese. Taq-polymerase wordt verkregen uit Thermus Aquaticus.
• nucleotiden
• Buffer (biedt een optimaal medium voor de activiteit van thermostabiel DNA-polymerase)

Werkingsprincipe van Polymerase Chain Reaction

PCR wordt een kettingreactie genoemd omdat de nieuw gesynthetiseerde strengen zullen fungeren als de sjabloon voor verdere synthese van DNA in de volgende cycli. 

PCR bestaat uit 3 opeenvolgende reacties:

• Denaturatie van DNA: Het proces van denaturatie scheidt de strengen van dubbelstrengs DNA. Voor menselijk DNA is de denaturatie temperatuur is ongeveer 93-95oC. De denaturatie van DNA wordt gedaan door de waterstofbruggen tussen de twee polynucleotidestrengen van het DNA te verbreken. Het denaturatieproces wordt vaak gedurende 5 minuten of langere tijd uitgevoerd om ervoor te zorgen dat beide strengen van het template-DNA volledig van elkaar zijn gescheiden. Het denaturatieproces activeert ook thermostabiel DNA-polymerase.
• Primer gloeien: Na denaturatie worden voorwaartse en achterwaartse primers in het reactiemengsel geïntroduceerd. De oplossing wordt vervolgens afgekoeld voor het gloeien van de primer. Gewoonlijk vindt primer-annealing plaats tussen 50-70^oC afhankelijk van de Tm (smelttemperatuur) van het DNA. Idealiter is de gloeitemperatuur 5^oC onder de Tm. De annealing-temperatuur moet laag zijn om een ​​hybride te vormen tussen de primer en het template-DNA en hoog genoeg om niet-overeenkomende hybriden te voorkomen. De Tm van het DNA hangt uitsluitend af van het GC- en AT-gehalte van het DNA. De primer-annealingstap duurt gewoonlijk 1-2 minuten. Tm kan experimenteel worden bepaald of theoretisch worden berekend met de onderstaande formule:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]^oC

• DNA-synthese: het thermostabiele DNA-polymerase (Taq-polymerase) bindt nabij de RNA-bindingsgebied en bevat de vrije nucleotiden om een ​​nieuwe DNA-streng naast de matrijsstreng te verlengen en te synthetiseren. De optimale temperatuur van de verlengingsstap hangt af van het type polymerase dat wordt gebruikt; voor Taq-polymerase is de optimale temperatuur ongeveer 72^oC. De duur van deze verlengingsstap hangt af van de lengte van het template-DNA en de efficiëntie van het thermostabiele DNA-polymerase; gewoonlijk is het één kilobaseparen per minuut.

Alle bovengenoemde reacties worden 30 keer herhaald om ongeveer 1 miljard kopieën van het template-DNA te krijgen.

Stadia van polymerasekettingreactie

Het PCR-proces is onderverdeeld in drie fasen:

• Exponentiële versterking: DNA-polymerase vervult de optimale functie en na voltooiing van elke cyclus wordt de hoeveelheid product verdubbeld. Er hoeft maar een kleine hoeveelheid van het DNA aanwezig te zijn bij het startpunt van de reactie, aangezien de reactie erg gevoelig is.
• Afvlakken fase: DNA-polymerase vertoont een mindere activiteit vanwege de verminderde beschikbaarheid van de reagentia zoals nucleotiden.
• Dienblad: er wordt geen product meer gevormd door uitputting van reagens.

Gebruik van polymerasekettingreactie

PCR kan worden gebruikt om talrijke genoomgebonden afwijkingen, een breed scala aan analyses en experimenten te identificeren. Enkele voorbeelden van het gebruik van PCR worden hieronder besproken:

• Identificatie van infectieuze agentia zoals CMV, Mycoplasma, Longontsteking, besmettelijke en Protozoaire gerelateerde ziekten, hepatitis, enz. in het monster.
• Bepaling van de maligniteit, in het bijzonder bij lymfoom en leukemie. 
• Vaderschapstesten en genetische vingerafdrukken. 

PCR maakt vroegtijdige identificatie mogelijk van afwijkingen die momenteel het meest ontwikkeld zijn in kankeronderzoek. PCR-metingen kunnen direct op de genomische DNA-monsters worden uitgevoerd om translocatiespecifieke kwaadaardige cellen te herkennen met een gevoeligheid van meer dan 10,000-voudig in vergelijking met elke andere methode. 

PCR identificeert ook niet-kweekbare en langzaam groeiende micro-organismen, zoals mycobacteriën, anaërobe micro-organismen en virussen, op basis van weefselkweektechnieken en diermodellen. PCR-demonstratieve toepassingen in de microbiologie zijn de herkenning van pathogenen en het vermogen om maak onderscheid tussen niet-pathogene en pathogene stammen door de specifieke genen te identificeren. 

PCR wordt gebruikt om een ​​kort stukje van een DNA-streng te versterken. Deze DNA-streng kan een compleet gen zijn of slechts een deel van een gen. In tegenstelling tot levende systemen, kan de PCR-cyclus slechts korte DNA-fragmenten versterken paren van maximaal 10 kilobasen. Verschillende andere technieken kunnen DNA-fragmenten tot 40 kb amplificeren, wat nog steeds kleiner is dan de grootte van chromosomaal DNA van een eukaryote cel - een menselijke cel bevat bijvoorbeeld ongeveer drie miljard nucleotide-basenparen. 

Vaderlijke testen kan worden uitgevoerd met behulp van PCR door het DNA te nemen van de personen die het geschil hebben. Het DNA van de proefpersonen wordt geamplificeerd en verteerd door middel van restrictie-enzymen en geanalyseerd met gelelektroforese. Het patroon van DNA-fragmenten op de agrose-gel staat bekend als de DNA-vingerafdruk van het individu. Nauw of bloedverwante personen hebben een soortgelijke DNA-vingerafdrukken patroon vergeleken met de in de verte verwante of niet-verwante individuen. De verkregen vingerafdrukken kunnen verder worden geanalyseerd voor het ouder-kind of broers en zussen met twee of meer genetische (DNA) vingerafdrukken. De DNA-vingerafdrukken verkregen kunnen worden gebruikt om te weten de evolutionaire relaties tussen de organismen. 

Door zijn grootte kan het eindproduct van de PCR gemakkelijk worden herkend agarosegel-elektroforese​ De agarosegelelektroforese wordt uitgevoerd door de DNA-monsters in de agarosegel te injecteren. De elektrische stroom wordt door de agarosegel geleid om de mobiliteit van de DNA-monsters te kennen. Kleinere DNA-fragmenten bewegen sneller in de gel en vice versa. Het PCR-product en het monster-DNA-fragment worden geïdentificeerd door een DNA-ladder in de agarosegel te introduceren. De DNA-ladder bevat DNA-moleculen van bekende grootte. 

Eerder was het identificeren van de genetische aandoening door het observeren van het genoom een ​​moeilijke klus. Later, door de ontwikkeling van PCR, wordt dit proces verkort. Elk gen dat van belang is, kan gemakkelijk worden geamplificeerd met behulp van geschikte primers en vervolgens kan de sequentie worden bepaald om mutaties in het DNA te detecteren. Vroegtijdige identificatie van sommige dodelijke virale infecties kan ook worden gedaan door middel van PCR. 

Soorten polymerasekettingreactie

Op basis van enkele geschikte aanpassingen in de techniek, Polymerase kettingreactie is ingedeeld in de volgende typen:

• Geneste PCR
• Omgekeerde PCR
• Omgekeerde transcriptie (RT-PCR)
• Asymmetrische PCR
• Kwantitatief (PCR-Q-PCR)
• Kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR)
• Touchdown-PCR
• Kolonie PCR
• Allelspecifieke PCR
• Assemblage PCR of Polymerase Cycling Assembly (PCA)
• Asymmetrische PCR
• Lineair na de exponentiële PCR (LATE-PCR)
• Uitbellen PCR
• Helicase-afhankelijke versterking
• Warme start PCR
• Intersequentie-specifieke PCR
• Omgekeerde PCR
• Ligatie-gemedieerde PCR
• Methyleringsspecifieke PCR
• Mini-primer-PCR

Voordelen van polymerasekettingreactie

• Polymerase Chain Reaction kan worden gebruikt voor de identificatie van een verscheidenheid aan genetische afwijkingen.
• PCR wordt gebruikt in een breed scala aan laboratoriumexperimenten en procedures in de moleculaire biologie.
• PCR kan maligniteiten detecteren zoals leukemie, lymfoom, enz., En verschillende andere aandoeningen zoals Toxoplasma gondi, Staphylococcale bacteriëmie, malaria-infecties, enz.
• Bij genetische vingerafdrukken en vaderschapstesten is PCR hun cruciale stap.
• De hoge gevoeligheid en specificiteit van PCR maakt het een belangrijk hulpmiddel voor op biotechnologie en moleculaire biologie gebaseerde experimenten.

Nadelen van polymerasekettingreactie

• Polymerase-kettingreactie vereist thermische cycler, DNA-elektroforetische assemblage, DNA-isolatiekit en andere kostbare chemicaliën, die het proces duur maken.
• Vereist getrainde, gekwalificeerde en ervaren technici voor het uitvoeren van experimenten.
• Laboratoriums voor basisveiligheidsniveau met ontvochtigers en laminaire stroming zijn vereist.
• Het is moeilijk om PCR-gebaseerde tests te betalen voor het gewone publiek.
• Niet alle ziekten konden met PCR worden geïdentificeerd en gediagnosticeerd.
• Mogelijkheid om fout-positieve en fout-negatieve resultaten te krijgen.

Polymerase-kettingreactie is een veelgebruikte en algemeen aanvaarde techniek voor de identificatie van verschillende dodelijke infectieuze agentia met gevoeligheid en specificiteit. PCR wordt gebruikt in verschillende geavanceerde medische centra, moderne laboratoria en medische instituten als routinematige diagnostische en onderzoeksmodule. Polymerase-kettingreactie speelt een cruciale rol bij de identificatie van afwijkingen die atypische klinische symptomen vertegenwoordigen; PCR maakt vroege detectie van dit soort beperkingen mogelijk. Vroege opsporing kan het individu op een veel betere manier helpen beheren, wat de sociale en economische last voor het gezin van de patiënt kan verminderen.

Om meer te weten over andere onderwerpen over biosynthese en biotechnologie klik hier

Conceptchecker MCQ's

Vraag nr. 1: Een student voert PCR uit om een ​​monster van template-DNA te amplificeren. Maar hij vergat DNA-primer toe te voegen aan het experiment. Welke van de volgende opties geeft het best mogelijke resultaat weer?

A- De reactie zal niet plaatsvinden.

B- Reactie zal werken, maar het proces zal niet-specifieke regio's versterken (niet het gewenste DNA-deel van DNA.

C- Reactie zal werken, maar met een langdurig tempo

D-Reaction zal werken, en het product zal ongewenste mutaties vertonen.

Optie A: "De reactie zal niet plaatsvinden" is het juiste antwoord.

Uitleg: Primers zijn essentieel voor het functioneren van PCR. Taq-polymerase heeft ze nodig om te binden (in de gloeistap) om te initiëren DNA-replicatie. De PCR zal dus niet werken in de afwezigheid van primers en er zal geen amplificatie plaatsvinden.

Vraag nr. 2: Een student / onderzoeker wil het humane hemoglobine-gen in een expressievector invoegen om het gen te klonen en tot expressie te brengen in muiscellen om het resulterende fenotype te analyseren. Met welke van de volgende procedures kan de student / onderzoeker het gen met succes klonen?

Optie A:

1. Versterk het gen via PCR

2. Gebruik een restrictie-enzym om de expressievector te knippen

3. Ligeer gen en de gedigereerde vector

Optie B: 

1. Ligeer het gen

2. Gebruik een restrictie-enzym om de expressievector te knippen 

3. Versterk het gen en de gedigereerde expressievector via PCR

Optie C:

1. Gebruik een restrictie-enzym om de expressievector te knippen

2. Versterk het gen via PCR

3. Ligeer gen en de gedigereerde vector

Optie D:

1. Gebruik een restrictie-enzym om de expressievector te knippen

2. Ligeer gen en de gedigereerde vector

3. Versterk het gen via PCR

Optie A: Is de te corrigeren optie 

1. Versterk het gen via PCR

2. Gebruik een restrictie-enzym om de expressievector te knippen

3. Ligeer gen en de gedigereerde vector

Uitleg: Ten eerste zullen we PCR gebruiken om het gen van belang uit het menselijke genoom met restrictieplaatsen aan de uiteinden te amplificeren (dit zal de ligatie ervan aan een restrictie helpen enzym verteerd vector). Later moet de expressievector worden gedigereerd met hetzelfde restrictie-enzym, en vervolgens werden de gedigereerde vector en het geamplificeerde gen aan elkaar geligeerd. Het eindproduct zal uit twee segmenten bestaan: de originele vector en het gen van belang.

Vraag nr. 3: Welk instrument wordt gebruikt om DNA-amplificatie door middel van PCR te voltooien?

A- Genetische analysator

B- UV-spectrofotometer

C-Thermocycler

D-centrifugeren

Optie C: Thermocycler is het juiste antwoord

Uitleg: De thermocycler kan worden ingesteld om een ​​cyclus van respectievelijk de denaturatie-, annealing- en verlengingsstadia te laten werken in een kleine hoeveelheid van het reactievolume. Een thermische cycler wordt gebruikt om PCR-amplificatie uit te voeren.

Voor meer berichten over Advance science, volg a.u.b. deze link.

Lees ook:

• Enkelvoudig onverzadigd vet versus meervoudig onverzadigd vet
• Hebben mitochondriën een kern?
• Biota-voorbeelden
• Voorbeelden van meervoudig onverzadigde vetten
• Voorbeeld van eencellig eiwit
• Is een chromosoom een ​​plasmide
• Kenmerken van maankwallen
• Hoe worden eigenschappen gemaakt?
• Voorbeelden van nucleïnezuren
• Trilobiet voorbeelden