Inhoud
- Denaturatie van DNA
- Renaturatie van DNA
- DNA-denaturatie door warmte | Thermische denaturatie van DNA
- DNA-denaturatie door NaOH-behandeling
- DNA-denaturatie door zout
- Welke PCR-stap veroorzaakt de denaturatie van dubbelstrengs DNA
- Effect van ureum op DNA-denaturatie
- Conclusies
- Vraag en antwoord interview
Wat is Denaturatie van DNA
Tijdens het kopiëren van DNA en ander ander fenomeen waarbij actieve deelname van DNA wordt waargenomen met de scheiding van strengen van dubbele DNA-helix.
Strengen van de dubbele DNA-helix kunnen eenvoudig worden gescheiden door opgelost DNA bij hoge temperaturen te verwarmen. De DNA-structuren scheiden vanwege de verstoring van de waterstofbruggen die de complementaire stikstofbasen die aanwezig zijn op de tegenovergestelde strengen bij elkaar houden. Dit fenomeen staat bekend als DNA-smelten.
De mate van smelten wordt bepaald door de smelttemperatuur (Tm) die wordt gekenmerkt als de temperatuur waarbij bijna 50% van de dubbele helixstructuur verloren gaat.
Strengen van dubbele DNA-helix kunnen ook worden gescheiden door toevoeging van alkali of zuur, waterstofbruggen worden verbroken door ionisatie.
Dubbel spiraalvormig DNA absorbeert minder UV-licht in vergelijking met de enkele DNA-streng vanwege de stapeling van basenparen. Wanneer DNA smelt, neemt het percentage enkelstrengs DNA toe, wat resulteert in een toename van het UV-absorptieprofiel. Dit fenomeen staat bekend als hyperchromiciteit. De mate van denaturatie of smelten kan dus worden gevolgd door de absorptie bij 260 nm te meten.
Renaturatie van DNA
Gescheiden DNA-strengen beginnen onmiddellijk te gloeien wanneer de temperatuur onder de T . daaltm waarde. Deze gloeicyclus wordt vaak renaturatie genoemd. De eigenschap van denaturatie en renaturatie is erg belangrijk voor het optimaal biologisch functioneren van het DNA.
In de cellulaire omgeving worden de DNA-strengen gescheiden door de werking van enzymen zoals helicase en topoisomerase ten koste van energie (ATP) en niet door de werking van hitte of extreme pH.
Het vermogen van DNA om reversibel te denatureren en opnieuw te hybridiseren geeft bewijs voor de genexpressie en voor de positie en structuur van een gen.
Stel bijvoorbeeld dat de DNA-deeltjes van twee verschillende levende organismen gedenatureerd zijn en toegestaan om opnieuw te hybridiseren of met elkaar te hybridiseren. De strengen zullen DNA-hybriden vormen als de sequenties op elkaar lijken. De mate van hybridisatie geeft de mate van overeenkomst aan tussen het DNA van twee organismen.
Soortgelijke waarnemingen kunnen worden gedaan met DNA en RNA in de cel om genen te lokaliseren.
Thermische denaturatie van DNA
DNA kan worden gedenatureerd door warmte en dit proces is hetzelfde als smelten. Het monster wordt verwarmd totdat het DNA afwikkelt en de twee strengen worden gescheiden. Als de strengen zijn gescheiden, zal het DNA op dat moment een constante temperatuur kunnen bereiken. Door dit proces kunnen strengen worden gevormd in de DNA-helix, die op dat moment complementaire paren creëren die als markers kunnen worden beschouwd.
Thermische denaturatie wordt zo nu en dan gebruikt bij het zoeken naar het verschil tussen verschillende soorten. DNA-denaturatie of smelten is echter een echt eenvoudig en direct proces, het wordt niet gebruikt wanneer precisie vereist is. Thermische DNA-denaturatie wordt als minder nauwkeurig beschouwd dan DNA-sequencing en wordt voor veel bredere toepassingen gebruikt. Dit soort denaturatie kan eveneens worden gebruikt binnen de polymeraseketenreactie.
DNA-denaturatie door NaOH-behandeling
Naast het verwarmen van het DNA-monster, kunnen chemicaliën zoals NaOH ook worden gebruikt om denaturatie van DNA te bereiken. Een specifieke concentratie NaOH kan worden gebruikt om DNA te denatureren. Omdat de hoeveelheid NaOH die wordt gebruikt wordt verlaagd, duurt de denaturatie langer dan verwacht, maar het DNA kan in ieder geval volledig worden gedenatureerd. Er is aangetoond dat NaOH misschien wel de beste en meest efficiënte strategieën zijn voor volledige denaturatie van DNA.
Verschillende chemische middelen, bijvoorbeeld formamide, kunnen DNA niet zo snel denatureren. Omdat NaOH in verschillende concentraties kan worden gebruikt, is het ook probleemloos te controleren. Bovendien kan het met NaOH gedenatureerde DNA worden gerenatureerd met behulp van een bufferoplossing van fosfaten. DNA dat is gedenatureerd door verschillende chemische middelen, zoals DMSO (Dimethylsulfoxide), kan op deze manier niet volledig worden gerenatureerd - en dit kan resulteren in het gebruik van NaOH voor meer toepassingen.
DNA-denaturatie door zout
Een grote hoeveelheid zout in het medium zorgt ervoor dat DNA normaal denatureert, gegeven de juiste verhouding zout. DNA-denaturatie met behulp van zout is als denaturatie met behulp van organische oplosmiddelen. over het algemeen kan DNA-denaturatie met behulp van zout niet worden gerenatureerd. Zout wordt vaak gebruikt in plaats van een zuur om DNA volledig te denatureren, en het kan ook samen met warmte worden gebruikt. Zout wordt over het algemeen niet gebruikt als het enige middel voor denaturatie - het wordt meestal gebruikt met een aantal verschillende chemische verbindingen zoals isopropanol en ethanol.
Dit proces kan worden gebruikt voor het denatureren van grotere hoeveelheden DNA, waardoor het minder nuttig is voor expliciet werk, maar waardevoller is voor het vergroten en verwerken van DNA in grotere hoeveelheden.
Er zijn echter tal van procedures die verband houden met DNA-denaturatie, het eindproduct is iets soortgelijks: de verbindingen tussen de strengen worden verbroken en er wordt enkelstrengs DNA geproduceerd, wat op verschillende manieren kan worden bepaald. De beste methode voor DNA-denaturatie is afhankelijk van waar het DNA voor moet worden gebruikt, hoe exact en expliciet de correlaties moeten zijn en het volume materiaal dat moet worden verwerkt.
In de regel kan zowel thermische denaturatie als zoutdenaturatie gemakkelijk worden opgeschaald en met grotere hoeveelheden worden gebruikt, terwijl NaOH-denaturatie iets nauwkeuriger en waardevoller kan zijn voor kleine hoeveelheden DNA.
Welke PCR-stap veroorzaakt de denaturatie van dubbelstrengs DNA
Scheiding van DNA-strengen vindt plaats in denaturatiestap van polymerase kettingreactie (PCR) die wordt beschreven in de volgende stappen:
Effect van ureum op DNA-denaturatie
Net als thermische en pH-geïnduceerde denaturatie van DNA, bezit ureum ook het vermogen om DNA te denatureren. Ureum in grote hoeveelheden pakt een problematische toestand voor nucleïnezuurstructuren aan. Aangezien ureum zowel donor als acceptor van waterstofbruggen is, kan het ongetwijfeld nucleïnezuren denatureren. Inderdaad, 6-8 M ureum is de kritische component voor denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (dPAGE) die algemeen wordt gebruikt voor de scheiding van DNA-oligonucleotiden op basis van grootte. In deze strategie worden dubbele DNA-helices volledig gedenatureerd en verplaatsen zich in polyacrylamide/agrosegel als lineaire polymeren.
Tot onze ongelooflijke verbazing gingen we over een DNA-deeltje dat een gevouwen structuur kan vormen in 7 M ureum (7MU), dat stabiel blijft tijdens de cyclus van 7MU-dPAGE. Dit komt door het feit dat dit DNA een zeer hoge concentratie guaninenucleotide bevatte en quadruplexstructuren vormde.
Conclusies
In dit artikel hebben we gesproken over DNA-denaturatie die zeer vaak wordt gebruikt in de moleculaire biologie als een effectief hulpmiddel om recombinant DNA te veranderen, te manipuleren en te vormen. We hebben denaturatie besproken in het licht van verschillende denatureermiddelen waarvan bekend is dat ze de stabiliserende krachten van DNA-structuur.
Vraag en antwoord interview
V1 Waarom wordt DNA gedenatureerd?
Antwoord: Zoals we weten is de stabiliteit van DNA belangrijk om elke levende cel goed te laten functioneren. Maar er zijn bepaalde gelegenheden waarbij denaturatie van DNA gunstig is voor de cel om normale levensprocessen uit te voeren. DNA denatureert om twee polynucleotidestrengen te produceren, het wordt uitgevoerd met behulp van specifieke enzymen zoals gyrase, topoisomerase en helicase en de denaturatie is vaak gelokaliseerd.
Belangrijke cellulaire processen zoals replicatie en transcriptie van DNA vereisen de scheiding van DNA. terwijl het denaturatiefenomeen vaak wordt gebruikt, zijn geavanceerde moleculaire biologietechnieken zoals polymerasekettingreactie, DNA-vingerafdrukken enz.
Q2 Wat veroorzaakt denaturatie?
Antwoord: DNA-strengen worden bij elkaar gehouden door niet-covalente interacties zoals waterstofbinding. Het verbreken van deze waterstofbruggen veroorzaakt scheiding van de DNA-strengen, wat bekend staat als denaturatie van DNA. De waterstofbruggen die aanwezig zijn tussen de nucleotiden van DNA kunnen op verschillende manieren worden verbroken.
- Denaturatie van DNA door warmte: Thermische denaturatie van DNA
- Denaturatie van DNA door extreme pH: pH-geïnduceerde denaturatie van DNA
- Denaturatie van DNA door zouten: Zoutoplossing induceert denaturatie van DNA
Q3-factoren die de denaturatie van DNA beïnvloeden
Antwoord: De denaturatie van DNA hangt af van de volgende factoren:
- Temperatuur: DNA van elk organisme heeft een vaste smelt-/denaturatietemperatuur
- pH: DNA denatureert bij extreme pH
- Osmolariteit en zoutgehalte: Extreme zoutconcentratie induceert ook denaturatie van DNA
- Guanine-Cytosine-gehalte: hoe hoger het GC-gehalte in het DNA, hoe hoger de smelttemperatuur
- Adenine-Thymine-gehalte: hoe hoger de AT in het DNA, hoe lager de smelttemperatuur
Q4 Denaturatietemperatuur van DNA
Antwoord: Wanneer de DNA-oplossing boven 90 . wordt verwarmdoC is de toename van de kinetische energie voldoende om de niet-covalente waterstofbindingen tussen de twee DNA-strengen te verstoren. Deze niet-covalente interacties zijn verantwoordelijk voor het stabiliseren van DNA. Verstoring van deze krachten leidt tot denaturatie van DNA. Over het algemeen is de smelttemperatuur van het DNA van elk organisme hoger dan 90oC.
V5 Bij welke temperatuur vindt denaturatie van de dubbele DNA-helix plaats?
Antwoord: Over het algemeen is de smelt- of denaturatietemperatuur van DNA van een organisme dichtbij of boven 90oC.
Q6 Hoe helpt de denaturatie van DNA om zijn structuren te analyseren?
Antwoord: Wanneer de denaturatie van DNA begint, neemt de UV-absorptie bij 260 nm geleidelijk toe en bereikt het maximum totdat de twee DNA-strengen volledig zijn gescheiden. De verandering in de UV-absorptie geeft een idee over de mate van denaturatie en renaturatie.
Q7 Waarom wordt gedenatureerd DNA niet vernietigd?
Antwoord: Denaturatie van DNA vindt plaats vanwege het verbreken van niet-covalente interacties, dus het wordt alleen gedenatureerd en niet vernietigd. Polynucleotidestrengen bestaan uit suikerfosfaatruggengraat en bestaan uit covalente bindingen (bindingen) die niet breken tijdens het denaturatieproces.
Q8 Is DNA-denaturatie omkeerbaar?
Antwoord: Ja, het DNA-denaturatieproces is omkeerbaar. Wanneer de temperatuur lager wordt, beginnen de gescheiden DNA-strengen opnieuw te hechten vanwege de vorming van waterstofbruggen tussen de complementaire sequentie van DNA. Herannealing van DNA bevordert het herstel van de dubbele helixstructuur van DNA en daarom is DNA-denaturatie een omkeerbaar proces.
Q9 Waarom is het gemakkelijker om DNA te denatureren dan eiwitten?
Antwoord: Zowel DNA als eiwitten kunnen worden gedenatureerd door gebruik te maken van denaturatiemiddelen zoals hitte, extreme pH, hoge zoutconcentratie en de aanwezigheid van andere chemische denaturatiemiddelen. Denaturatie van DNA is gemakkelijk te begrijpen, terwijl denaturatie van eiwitten een complex fenomeen is omdat de structuur van eiwitten wordt gestabiliseerd door zowel covalente als niet-covalente interacties. Sommige eiwitten kunnen heel gemakkelijk denatureren, terwijl sommige eiwitten onder zeer extreme omstandigheden denatureren.
Q10 Als DNA geen eiwit is, waarom zeggen we dan dat DNA gedenatureerd kan worden?
Antwoord: Van een biomacromolecuul wordt gezegd dat het wordt gedenatureerd wanneer het zijn structurele integriteit begint te verliezen of wanneer het van structuur verandert. Omdat DNA ook een goed gedefinieerde structuur heeft, kunnen we dus zeggen dat DNA wordt gedenatureerd wanneer de structuur van DNA verandert.
Q11 Waarom worden controles gebruikt tijdens elektroforese?
Antwoord: Controles (positief en negatief) worden vaak gebruikt wanneer we de elektroforese van DNA uitvoeren. We gebruiken controle om de status van de structuur van het DNA-monster te controleren (of het nu dubbelstrengs, enkelstrengs, gedeeltelijk dubbelstrengs, gekerfd enz. is). Dubbelstrengs DNA loopt sneller in de agarosegel in vergelijking met enkelstrengs DNA, terwijl nicked DNA het langzaamst loopt.
Q12 Wat gebeurt er als DNA beschadigd is?
Antwoord: Het beschadigde of gepikte DNA loopt het langzaamst, blijft achter en heeft een lage mobiliteit. Aldus bestrijkt of beschadigd DNA korte afstanden in de agarosegelelektroforese.
Q13 Welke bindingen breken het eerst wanneer de denaturatie van eiwitten optreedt?
Antwoord: Waterstofbindingen samen met andere niet-covalente interacties (hydrofoob, vanderwaalkrachten) worden eerst verstoord, terwijl covalente interacties zoals disulfidebindingen als laatste worden verbroken tijdens het denaturatieproces.
Vraag 14 Hoe wordt DNA overgedragen van door hitte gedode S-stam naar ruwe R-stam, gezien het feit dat het DNA denaturatie kan ondergaan?
Antwoord: Tijdens het hittedoding van de virulente S-stam van Pnuemokoccus wordt zijn DNA gedenatureerd, maar wanneer het wordt gemengd met de R-stam, is de temperatuur niet zo hoog. Dus DNA kan tijdens het mengproces opnieuw worden geannexeerd en zijn functionaliteit hersteld.
Vraag 15 Kan het denatureren van eiwitten betekenen dat ze worden opgesplitst in meer fundamentele maar functionele detecteerbare delen?
Antwoord: Nee, Denaturatie is alleen bedoeld om de structuur van biomacromoleculen te veranderen. Verandering in structuur brengt een verandering of verlies in functie van deze moleculen teweeg. Denaturatie betekent niet vernietigen of breken in fundamentele eenheden. Denaturatie is geen vertering.
Q16 Wat is het verschil tussen thermisch stabiele DNA-polymerase en normale DNA-polymerasen?
Antwoord: Thermo stabiel DNA-polymerase wordt verkregen uit een extremofiele bacterie Thermus aquaticus, het verschilt van het normale DNA-polymerase omdat het replicatie kan uitvoeren van DNA, zelfs bij een temperatuur boven 90oC.
Vraag 17 Waarom vertoont de denaturatie van langere DNA-helices meer coöperativiteit dan de denaturatie van korte strengen?
Antwoord: Omdat de grotere DNA-strengen meer nucleotiden bevatten, zijn er meer kansen op het vormen van complementaire basenparen, zijn er meer kansen op de vorming van een groot aantal waterstofbruggen. Daarom vertonen grotere DNA-fragmenten meer coöperativiteit.
Vraag 18 Waarom denatureert NaOH DNA?
Antwoord: De introductie van NaOH verhoogt de pH van het medium en maakt het alkalisch, OH-ionen die vrijkomen uit NaOH interageren met Guanine en Thymine en bevorderen het verbreken van waterstofbruggen, wat uiteindelijk leidt tot denaturatie van DNA.
Vraag 19 Kan de denaturalisatie van DNA veroorzaakt door formaldehyde de DNA-fingerprinting beïnvloeden?
Antwoord: Nee, Formaldehyde heeft geen invloed op de uitkomst van DNA-vingerafdrukken. Omdat DNA-fingerprinting restrictiedigestie vereist en restrictie-enzymen specifieke sequenties in het dubbelstrengs DNA herkennen. Formaldehyde kan DNA denatureren, maar na de verwijdering van formaldehyde (omdat het alleen wordt gebruikt in het fixatieproces na elektroforese) keert DNA terug naar zijn oorspronkelijke conformatie, dus DNA-fingerprinting wordt niet beïnvloed.
Vraag 20 Is er een ander instrument beschikbaar dat gedenatureerd DNA kan onderscheiden van normaal DNA, behalve door middel van gelelektroforese?
Antwoord: Ja, er zijn enkele hulpmiddelen en instrumenten die werken volgens het principe van spectroscopie voor het bepalen van de smelttemperatuur en daaruit kunnen we onderscheid maken tussen gedenatureerd en normaal DNA. Een andere techniek is agarosegelelektroforese van DNA-monsters.
Vraag 21 Wat is het effect op denaturatie van DNA als Tm-waarde wordt verhoogd relatie tussen Tm-waarde en denaturatie van DNA?
Antwoord: De hogere Tm-waarde geeft aan dat de DNA-structuur meer stabiliteit heeft in vergelijking met het DNA met een lagere Tm-waarde.
Lees ook:
Ik ben Abdullah Arsalan, heb mijn doctoraat in de biotechnologie afgerond. Ik heb 7 jaar onderzoekservaring. Ik heb tot nu toe zes artikelen gepubliceerd in tijdschriften met een internationale reputatie met een gemiddelde impactfactor van 6, en er zijn er nog een paar in behandeling. Ik heb onderzoekspapers gepresenteerd op verschillende nationale en internationale conferenties. Mijn interessegebied is biotechnologie en biochemie met speciale nadruk op eiwitchemie, enzymologie, immunologie, biofysische technieken en moleculaire biologie.
